供应Wako SuperSep Phos-tag 蛋白磷酸化预制胶系列产品

SuperSep Phos-tag™

SuperSep Phos-tag™ 是研究蛋白磷酸化的方法，无需特异性磷酸化抗体或者同位素标记。

◆SuperSep Phos-tag™

Phos-tag™ 是一种预制胶，预先加入了 50 μmol/L 的 Phostag™ Acrylamide，打开包装即可直接使用。预制胶中含有锌作为金属离子，在中心凝胶缓冲液中保存稳定性很好，得到的带条结果也很整齐。

磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白作为不同条带分离。

分离后，胶可用于考马斯亮蓝染色，免疫印迹和质谱实验。

◆Phos-tag™ SDS-PAGE 的原理

◆在 HighWire Search 上搜索到的论文数

◆运用

利用 p35 的丙氨酸突变体确定 Cdk5 激活 p35 的磷酸化位点

p35 常见的磷酸化位点是 Ser8 和 Thr138。但是 Ser8 和 Thr138 位点往往会发生丙氨酸突变，产生３种突变体（Ser8 突变体：S8A，Thr138 突变体：T138A，Ser8 和 Thr138 双突变体：2A）。这３种突变体、野生型 p35、Cdk5 和没有激酶活性的 Cdk5 都来源于 COS-7 细胞。这些细胞裂解液用Phos-tag™ SDS-PAGE 和 Western blotting 进行检测（检测抗体：p35 抗体）。

100 μM Phos-tag ™ 丙烯酰胺, 7.5% 聚丙烯酰胺凝胶

可明确磷酸化位点和条带迁移率的关系！

– 泳道１（条带 L2 和 L4）和泳道５（条带 M1）：p35 在 Cdk5 的作用下发生了磷酸化；

– 泳道１（条带 L2 和 L4）和泳道３（条带 L2 和 L4）：在无激酶活性 Cdk5 的作用下，大约有一半 p35 蛋白在 Thr138 位点发生磷酸化，同样在 138 位发生突变的 p35 蛋白亦是如此。

– 泳道５ （条带 M1）和泳道６（条带 L3 和 L4）：Ser8 和 Thr138 是主要的磷酸化位点；

– 泳道５（条带 M1）、泳道７（条带L1和L2）和泳道８（条带M2）：条带 M1 是 Ser8 和T hr138 都发生磷酸化的条带；

条带 M2 是只有 Ser8 磷酸化的条带；条带 L1 和 L2 是只有 Thr138 磷酸化的条带。

※ 条带 L1 和 L3 中的Ｘ是不确定哪个位点发生磷酸化的条带；

※ 条带L4是非磷酸化的 p35 。

【参考文献】

▪ Quantitative Measurement of in Vivo Phosphorylation States of Cdk5 Activator p35 by Phos-tag ™ SDS-PAGE. T. Hosokawa, T. Saito, A. Asada, K. Fukunaga, and S. Hisanaga,Mol. Cell. Proteomics, Jun 2010;9: 1133 – 1143.

【结果提供】

理化学研究所 脑科学综合研究中心 回路功能研究核心 记忆功能研究团队 细川智永（Dr. T. Hosokawa）

首都大学东京 理工学研究科 生命科学专业 神经分子功能研究室 久永真市（Dr. S. Hisanaga）

检测含有 Dnmt1 磷酸化激酶的片段

我们可以确定在片段中含有目的激酶！

① 采用亲和色谱法从鼠脑提取液中纯化 GST-Dnmt1（1-290）结合蛋白

② 使用 0.3 M 和 1 M NaCl 的 DNA 纤维素柱洗脱得到目的蛋白

③ GST-Dnmt1（1-290）作为体外激酶实验的反应底物

④ Phos-tag ™ SDS-PAGE 用于Western blotting，确定迁移条带中每个片段的激酶活性

【参考文献】

The DNA-binding activity of mouse DNA methyltransferase 1 is regulated by phosphorylation with casein kinase 1delta/epsilon. Y. Sugiyama, N. Hatano, N. Sueyoshi, I. Suetake, S. Tajima, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, and I. Kameshita, Biochem. J., May 2010; 427(3): 489-97.

【结果提供】

高知大学 综合研究中心 生命、功能物质部门 实验实习机器设施 杉山康宪（Dr. Y. Sugiyama）

香川大学 农学部 应用生物科学科 动物功能生化学研究室 龟下勇（Dr. I. Kameshita）

二维电泳中的应用：分析 hnRNP K 磷酸化异构体

小鼠巨噬细胞 J774.1 经 LPS 刺激后，裂解细胞，经过免疫沉淀法分离得到 hnRNP K。在二维电泳中，一维是 IPG 胶，二维是 Phos-tag ™ SDS-PAGE，可分离 hnRNP K 的异构体。利用质谱仪，可以确认不同的点代表不同的亚型或修饰蛋白。

同一个等电点的位置上，不同位点发生磷酸化都可以被区分开来

（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）

【参考文献】

▪ Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics, Nov 2010; 10(21): 3884-95.

【结果提供】

横滨市立大学 生命纳米系统科学研究科 生物体超分子系统科学专业 木村弥生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）

理化学研究所 RCAI 小原收

◆备注

样品制备：

Phos-tag SDS-PAGE 对于蛋白样品中的杂质非常敏感，尤其是螯合剂，钒酸，无机盐，表面活性剂这类物质。

强烈建议在 Phos-tag SDS-PAGE 之前通过 TCA 沉淀或渗析法降低杂质含量。

转膜前处理：

另一个必须的步骤是在转膜前，用 EDTA 去除凝胶中的金属离子（Mn²⁺ 或者Zn²⁺）；该步骤可提高蛋白的转膜效率。

●　分别准备 10 mmol/L 含 EDTA 和不含 EDTA 两种 1x transfer buffer。

●　将凝胶浸泡在含 10 mmol/L EDTA 的 1x transfer buffer，至少 20 分钟，温和摇晃。更换新缓冲液，重复３次。

●　将凝胶浸泡在不含 10 mmol/L EDTA 的 1x transfer buffer，10 分钟，温和摇晃。

●　转膜操作*。

* 建议用湿法转膜，以提高转膜效率。

◆质量控制

每一批 SuperSep Phos-tag™，出厂前均根据其产品规格进行测试，以保证可分离磷酸化和非磷酸化蛋白，以及他们的分离成都在正常参数内。

◆保存温度：2-10℃

Wako SuperSep Phos-tag 蛋白磷酸化预制胶系列产品  ◆产品信息