环氧活化琼脂糖凝胶6B Epoxy activated Sepharose 6B使用说明书

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环氧活化琼脂糖凝胶6B Epoxy activated Sepharose 6B使用说明书

环氧活化琼脂糖凝胶6B
品牌: 金畔生物
英文名称: Epoxy activated Sepharose 6B
说明:分离试剂
产品简介
环氧活化琼脂糖凝胶6B以6%琼脂糖凝胶为基质，采用环氧活化的方法激活琼脂糖上的羟基,活化后即可直接用于各种配基的偶联。可用于各种含有氨基、巯基或羟基的亲和配基(蛋白质、多肽、氨基酸或糖等)的偶联。具有使用方便、偶联条件温和、偶联效率高和应用范围广的特点。
GRADE: BR
基质: 6%高度交联琼脂糖凝胶
功能基团: epoxy
配基密度: 20-40umoles/mL drained matrix
平均粒径: 90um
最大流速: 300cm/h
偶联条件: pH8-10,温度 4 45°C时间1-16小时，可在水相和有机相中偶联
用途:亲和层析介质
性状:白色胶体;
储存温度: 4-8°C
使用说明:
1、溶液的准备
偶联液:0.1M Na2CO3, pH8. 5-10.0
封闭液: 1M乙醇胺, pH8.0
清洗液1: 0.1M 乙酸~乙酸钠，0.5M NaCI, pH4.0
清洗液2: 0.1M Tris-HCl, 0.5M NaCI, pH8.0
保护液:含20%乙醇的1XPBS
2、样品准备
样品用偶联液溶解，浓度约5-10mg/ml。
3、样品偶联
1)取适量的环氧活化琼脂糖凝胶6B,去除保护液，离子水清洗三次，用偶联液清
洗一次。
2)将溶解好的样品中溶解后转入清洗好的环氧活化琼脂糖凝胶6B中填料:样品.
溶液体积比约为1:1。
3) 25- 40°C摇床中振荡混合反应24h。注:确保树脂悬浮起来,否则会大大影响偶联效率。
4)反应完后收集偶联样品，以便检测偶联效率。偶联液清洗一遍。
5)加入等体积的封闭液，37 度振荡混合反应1h。
6)将上述反应体系取出，流干其中的溶液，用3倍柱体积的去离子水清洗树脂，清洗液1、去离子水、清洗液2和去离子水
重复冲洗2次,然后保存在等体积的保护液中，于29C-89C保存。
注意事项:
1.不同配基的偶联方法与上面类似，但是反应的条件例如:配基加入量,反应时间，反应温度应根据配基的不同进行适当的
调整
2.可用碳酸盐、硼酸盐和磷酸盐缓冲液做为偶联缓冲液,但绝对不能使用含有氨基的Tris、甘氨酸的缓冲液。

下面简要介绍环氧活化琼脂糖微球偶联含氨基配基的使用过程

环氧活化琼脂糖微球FF 是将环氧基团键合在琼脂糖微球 6FF 上冻干形成的一种活性中间体，可直接偶联含氨基、巯基和羟基的配基制备分离介质，用于生物大分子的纯化分离。

  • 干粉的溶胀（非干粉形态忽略此步骤）

称取一定量的环氧活化高流速琼脂糖微球冻干粉，在蒸馏水中悬浮溶胀（1g 干粉约溶胀为 3～4ml 凝胶），放置大约 1 小时后抽滤，并用约 200ml（PH 7）去离子水洗涤干净其中的添加剂，并在漏斗中抽干。

  • 配基的偶联

一般配基偶联的过程如下：

  • 偶联溶剂：可用去离子水、碳酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。不能用含氨基和其他含亲核试剂的溶液。有时需要有机溶剂溶解配基，如用 50%二甲基甲酰胺和二氧六环等。
  • 取一定量的配基溶解到偶联用的缓冲溶液中，使其完全溶解，最低浓度为200μmol

配基/ml 凝胶。凝胶与缓冲溶液以 1：0.5 到 1：1 的比例混合悬浮反应。

  • 将溶胀的凝胶悬浮到含有配基的缓冲溶液中，在20℃~45℃的水浴中摇荡 16 小时。也可以用其他搅拌方法使配基偶联，请勿用磁力搅拌。
  • 反应完全后，再洗涤掉缓冲液中的多余的配基。
  • 残余活性基团的消除，将反应完洗涤过的凝胶悬浮到 1mol/L乙醇胺（PH 8）的溶液中，在 40℃~50℃最少反应 4 小时或者室温反应过夜。
  • 在反应完后，用含有 5mol/LNaCl 的 0.1mol/L 醋酸缓冲液（PH 4.0）和含有 0.5mol/LNaCl 的偶联缓冲液（PH 8.3）交替洗涤，至少重复以上循环洗涤 3 次。
  • 装柱

⑴让所有的材料和试剂达到室温。配制初始缓冲液（平衡液）和洗脱缓冲液。

⑵根据柱子大小取所需量的凝胶，清洗掉溶液，抽干，用初始缓冲液（按凝胶：缓冲液

=3：1  的比例）配成匀浆。匀浆作脱气处理。

⑶将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位（液面略高于滤膜），务必使底端无气泡。

⑷用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意勿使产生气泡。打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。

⑸打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的 1.33 倍的流速流过，使柱床稳定。用 2~3 倍柱体积的缓冲液平衡柱子。

  • 平衡

让平衡缓冲液以一定流速流过柱子，到流出液电导和 pH 不变。平衡缓冲液一般是根据需要纯化的蛋白来决定用哪种缓冲液。

  • 上样

⑴样品用平衡液配制，浑浊的样品要离心和过滤后上样。

⑵一般情况是让目标产品结合在柱子上，用平衡液洗去杂质，再选择一种洗脱液洗下目标产品。

⑶介质对样品组分吸附的程度取决于介质配基的亲和作用、样品的亲和性质、流动相的组成和温度。

(4)再用缓冲液平衡到流出液电导和 pH 不变。

  • 洗脱

洗脱液也要根据需要纯化的蛋白决定。

  • 再生

对于使用之后的凝胶，以 2~3 倍柱体积的 0.1mol/L Tris·HCl+0.5mol/L NaC（l PH=8.5）

和 0.1mol/L NaAc+0.5mol/L NaCl（PH=4.5）依次反复冲洗 3~4 次，进行再生。

  • 在位清洗

根据偶联的配基选择在位清洗的方法，以洗去柱子污染物同时不伤害柱子为原则。对于一般的污染，用 0.1mol/L NaOH 进行较长时间的清洗，对配基基本没有的影响；当严重污染后，可用 0.5mol/L NaOH  进行短时间的清洗；对于介质中含有其他试剂的，可用含有 8 mol/L尿素和 6 mol/L  的盐酸胍的溶液进行在位清洗。若有失活蛋白或脂类物质洗不干净，可用非离子表面活性剂如 0.1% Triton 洗涤。

清洗完毕后，用至少 3 倍缓冲液平衡柱子。

  • 注意

在装柱、使用和保存柱子的时候，要避免柱子流干，气泡进入。