HS Probe qPCR Mix with UDG
Cat. #：P2301，P2302，P2303，P2304，P2305
产品简介
HS Probe qPCR Mix with UDG是用于探针法实时定量PCR的2×浓缩预混液，使用时只需加入模板、引物和探针即可进行反应。本品含有类抗体技术修饰的热启动酶Hotstart Taq DNA聚合酶，配合东盛特制的Real Time PCR Buffer，不仅有效抑制引物二聚体和其他非特异性扩增，而且能够提高扩增效率，可以进行高灵敏度高特异性的PCR反应。该试剂引入了 dUTP/UDG 防污染系统，可以在PCR反应前清除含dUTP的PCR产物，有效避免因扩增产物的交叉污染对定量的影响。本品在宽广的定量域内具有良好的线性关系，对靶基因定量准确、可信度高，重复性好。本品可搭配TaqMan等各类荧光探针使用，与常见定量PCR仪完美兼容，如ABI、Roche、Bio-Rad等。
产品组成
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Component |
P2301 |
P2302 |
P2303 |
P2304 |
P2305 |
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2× HS Probe qPCR Mix with UDGa |
1 ml |
1 ml×5 |
1 ml×10 |
1 ml×50 |
1 ml×100 |
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超纯水 |
1 ml |
1 ml×5 |
– |
– |
– |
a 包含Hotstart Taq DNA聚合酶，dNTP/dUTP Mix，UDG（Uracil-DNA Glycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶）及反应缓冲液等。
保存条件
-20℃保存2年，4℃可短期保存。
质量控制
纯度检测：经质量检测，产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。
功能检测：经不同来源的模板和引物检测，产品具有优秀的特异性、灵敏性及可重复性等。
应用举例
1. 配制反应体系
请于冰上配制以下反应体系：
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Component |
Volume |
Final concentration |
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DNA template[1] |
1-4 μl |
Variable |
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Forward primer (10 μM)[2] |
0.4 μl |
0.2 μM |
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Reverse primer (10 μM)[2] |
0.4 μl |
0.2 μM |
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2× HS Probe qPCR Mix with UDG |
10 μl |
1× |
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Probe (10 μM)[3] |
Variable |
0.1-0.5 μM |
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ddH2O |
Variable |
– |
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Total volume[4] |
20 μl |
– |
[1] DNA模板建议用量（20 μl体系）：1-10 ng cDNA，或10-100 ng gDNA。加样体积不宜过小，以免造成较大的误差，但未稀释的cDNA不宜超过总体积的1/10。因此模板建议浓度（加样前）：cDNA 1-10 ng/μl，gDNA 10-100 ng/μl。
[2] 引物终浓度建议范围：0.1–1.0 μM, 通常引物终浓度为0.2 μM效果较好。
[3] 使用探针的浓度与Real Time PCR扩增仪、探针种类和荧光标记物种类有关，使用时请参照相关说明。通常探针终浓度在0.1-0.5 μM之间。
[4] 建议总体积不小于10 μl，以免造成较大的加样误差。具体体积范围参考仪器说明。
注意：对于某些固定型号的仪器，需要添加ROX才能精确测定Ct值。由于ROX的使用体积较小，建议将ROX提前与qPCR Mix混匀使用。ROX用量参照具体仪器说明，下表仅供参考。
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Instruments |
ROX (100X) |
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ABI PRISM 7000/ PRISM 7700/ 7300/ 7900HT/ Step One/ Step One Plus/ GeneAmp 5700 |
1-2% (High ROX) |
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ABI 7500/ 7500 Fast/ ViiA 7/ QuantStudio 6/7/12K Flex; Agilent Stratagene Mx3000P/ Mx3005P/ Mx4000 |
0.2% (Low ROX) |
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Bio-Rad CFX96/ CFX384/ iQ/ iQ5; MJ Research Opticon 2/ Chromo 4; Roche LightCycler 480/ 96; Corbett Rotor Gene G/ Q/ 3000/ 6000; Thermo PikoReal 96; Eppendorf MasterCycler ep realplex; Cepheid Smart Cycler |
No ROX |
2. 设定反应程序进行qPCR反应
两步法程序示例如下：
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Stage |
Temperature |
Time |
Cycle |
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UDG pre-treatment |
37℃ |
2 min |
1 |
|
Initial denaturation |
95℃ |
3 min |
1 |
|
Denaturation |
95℃ |
10 sec |
40 |
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Annealing & Extension[1] |
60℃ |
30 sec |
[1] 仪器在此阶段进行信号采集。请根据仪器类型设置反应时间。如需优化温度，建议在55-65℃范围内调整。
若反应效果不佳，建议采用三步法扩增程序。
经典三步法程序示例如下：
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Stage |
Temperature |
Time |
Cycle |
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UDG pre-treatment |
37℃ |
2 min |
1 |
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Initial denaturation |
95℃ |
3 min |
1 |
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Denaturation |
95℃ |
10 sec |
40 |
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Annealing[1] |
60℃ |
15 sec |
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Extension |
72℃ |
20 sec |
[1] 仪器在此阶段进行信号采集。常用退火温度在55-65℃之间。退火温度一般设定为所用引物的Tm-5℃，若低于55℃，则以Tm值为退火温度，一般不低于55℃。请根据仪器类型设置反应时间。
3. 分析结果
观察扩增曲线；调整基线，计算Ct值；进行相对或绝对定量。
注意事项
1 使用前Mix需要完全解冻，充分混匀。尽量避免多次反复冻融。短期使用可保存于4℃。
2 将（n+x）份反应液混匀后再分注到n个单管中，可降低加样误差。（n为重复次数，x为损耗量，一般为n的1/10）
3 ABI的定量仪器大部分需要ROX校正管间差异，Bio-Rad的定量仪器不需要ROX校正。具体仪器请参照其使用说明。
4 轻轻混匀反应液，避免产生气泡，气泡会干扰荧光检测。可瞬时离心去除气泡。
5 引物的特异性、用量以及退火温度是影响实验结果的重要因素。务必设计特异性好的引物，随实验结果适当调整引物用量（0.1 μM-1.0 μM）——特异性较差时减少引物用量，或以3℃为增量提高退火温度，扩增效率较低时增加引物用量。
6 DNA模板的量应小于500 ng/反应，过高的模板量会引起非特异性扩增。应根据模板类型与基因表达量适当调整用量。
7 各类探针应参照相应的指南进行设计，并根据所用扩增仪类型、探针种类和荧光标记物种类等调整用量。