DEAE-纤维素 DE-52 使用说明
DEAE-纤维素(52)
使用说明书
简介
DEAE-纤维素，它采用平均粒径为50μm的颗粒型亲水高分子聚合物，表面又用大
分子糖链接枝，使它有更高的比表面积和更好的生物兼容性，它在高流水下保持
更高载量，同时又具有更好的分辨率。由于比表面积大，平衡和洗脱的时间也更.
短。它经过接枝即使是纯化病毒，质粒等超大分子的物质，载量基本保持不变。

关于DEAE52纤维素的处理只有简单的几步，如下:

1.先将干粉的纤维素浸泡在蒸馏水中，一段时间大约3小时左右，我偏爱这个时间，去除杂质，最好抽干一下；
2.再用0.5mol/l的HCl溶液浸泡2小时，用去离子水洗净至PH中性，并抽干；
3.将抽干的纤维素再浸泡在0.5mol/l的NaOH溶液中2小时，用去离子水洗至中性，抽干。即可用了
对于用过的纤维素，可以重复利用多次，但需要经过再生处理后才可以使用。再生处理可先用高浓度NaCl (1－2 mol/L)过柱冲洗柱床，以除去DEAE－52阴离子交换纤维所吸附的成份。然后，再用0.5 mol/L的HCl和NaOH处理，处理方法与预处理完全相同。

DEAE－纤维素的处理及装柱
（1）处理
本实验采用的是DEAE－纤维素DE 52 是弱酸型阴离子交换剂，具体处理方法为：先将DE52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5N的HCL溶液中浸泡1－2h,再用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或PH4以上，并将其在抽滤漏斗中抽干；将抽干的离子交换剂浸泡在0.5N的NaOH溶液中1－2h，再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性。
（2）装柱
将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱材，轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降再层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5－2cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。
（3）平衡

在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.002M Tris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA)，预先将DE-52柱进行平衡。

DEAE—纤维素的活化

称取IgDEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后DEAE的体积。根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE的用量，称取所需DEAE用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。抽干，改用0.5ml/LNaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH至8左右（用pH试纸检查）。再改用0.5ml/LHCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。本实验中在用前应以0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。

DEAE—纤维素的再生
用过的离子交换剂可以反复使用，使其恢复原状的方法俗称“再生”。再生并非每次用酸、碱反复处理，通常只要“转型”处理即可。所谓转型就是使交换剂带上所希望的某种离子，如希望阳离子交换剂带上NH+4则可用NH4OH浸泡，如希望阴离子交换剂带上Cl—则用NaCl溶液处理。本实验中DEAE—纤维素在酸碱处理后，用0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲溶液浸泡即可转型，以HPO4取代DEAE中的OH—。一般由于DEAE—纤维素使用后因带有大量杂蛋白，所以再生时，先用0.5ml/L NaOH浸洗，用去离子水洗至pH8左右，再转型，即可再使用。

三、应用的注意事项:
1)色谱柱装填
1、所需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样,液体最好做脱气处理。
填料可直接称量需要的量用缓冲液溶涨一小时装柱即可.
2、在柱子下端加入20%乙醇，以除去柱子中的空气，关闭柱子出口，在柱
内保留少量的20%乙醇。20%乙醇容易产生气泡，可以在里面加1%吐温避免气泡产生。也可以换成纯水装柱子，但是需要把填料中的20%乙醇也换成纯水，具体
的方法取需要体积的填料在抽滤漏斗上进行，也可以小心倾去填料上的20%乙
醇，再换成5倍体积的纯水，反复沉淀去上清，5次左右就可以用于装柱子。
3、此填料颗粒比较细，所以一定 要注意柱子要选择合适的筛网，不能漏，
也可以取点填料加到筛网.上试试，如果没有问题再将填料连续倒入柱子时，要用
玻璃棒的紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产生，让填料先自然沉降到填料体积
不再变化，而填料和上面的液体很好分层，上层溶液完全澄清，就可以开泵用适
当的流速压柱子，填料体积不再变化后，再把转换头紧顶在填料上就可以平衡柱
子使用。使用的流速要小于装柱子的流速。
4、在装柱子前，填料从冰箱中取出至少要室温放置2-3个小时，这样避免
装柱子时由于温度变化而使柱子中产生气泡。
2)蛋白的结合
样品的盐浓度和pH要尽量和平衡柱子的缓冲液-致,盐浓度过高或者pH带
低也许挂不上，所以要根据自己的样品做适当调整。
3)蛋白的洗脱
这个填料如果采用线性梯度洗脱，柱子的直径和高度比最好是大于10,数值
越大越有利于分离，而且样品最好别上太多，可以按约10mg/ml.上样，如果采用
阶段洗脱的方法，装短粗柱子就可以，上样量也没有限制。阶段洗脱容易放大，
重复性好，如果洗脱条件好完全可以得到和线性梯度一样或者更好。采用什么方
法完全根据自己需要。
四、再生清洗
1、每次用完最好用含2M NaCl洗5个床体积，再用水洗5个柱床体积，然后用
20%乙醇保存，使用3-5次后在水洗之后再用70%的乙醇或30%异丙醇都含1%吐
温洗5个柱床体积，最后20%的乙醇流洗5个柱床体积。
2、有机溶剂和水混合很容易产生气泡，为了避免这样情况，可以把配好的有
机溶剂在室温放置过夜，再使用，这样可以避免气泡进柱子而导致柱子不能正常
使用。
五、保存
在20%乙醇中，4’C下长期保存。