细胞质与细胞核RNA小量提取试剂盒250T品牌：JinPan | 货号：EK-1315-250T
FastPure Cytoplasmic & Nuclear RNA purification Kit HandBook
FastPure 细胞质和细胞核 RNA 小量提取试剂盒说明书
产品组成
产品介绍
本试剂盒可以快速地从哺乳动物细胞或组织中提取细胞质或细胞核 RNA，不含酚氯仿等有毒试剂。
其提取的总 RNA 纯度高，无蛋白质及其它杂质污染，可用于 RT-PCR、Real Time RT-PCR、mRNA 差异
显示、分子克隆等多种下游实验。本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品级化妆品等用
途。
存储条件
Buffer RN 置于 2-8℃保存；Buffer RT 可室温（15℃-25℃）干燥放置至少一年，加入 β-巯基乙醇（或
DTT）的 Buffer RT 可室温放置一个月；其他试剂室温干燥保存可至少稳定 12 个月。
需要额外准备的材料
14.3 M β-巯基乙醇(β-ME) (常规购买商业化商品即为 14.3 M)或 2M DTT
70%乙醇：RNase-Free 水配制
无水乙醇（96%-100%）
无酶 1.5ml 离心管
无酶吸头
干净的手套
高速离心机
物理研磨设备
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
操作前在 Buffer RT 中加入 β-巯基乙醇（
β-ME）至终浓度为 1%（建议现配现用），如 1 ml Buffer RT
中加入 10μl β-巯基乙醇(或加入 20 µl 的 2 M DTT)。配好的 Buffer RT 可在 4℃维持稳定一个月。
Buffer RT 在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请 37℃加热溶解后室温使用。
Buffer RW1 作为浓缩液提供，在第一次使用前加入 0.25 倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
Buffer RPE 作为浓缩液提供，在第一次使用前加入 4 倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
如果执行可选的柱上 DNA 酶消化步骤，请制备 DNase I 储备液：将 DNase I 干粉（1500 U）溶解在
550μl RNase-Free ddH2O 中，轻柔混匀（禁止涡旋），分装后-20℃贮存（可保存 9 个月）。
RNase-free 水中不含任何抑菌因子，室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染，使用时尽量注意，
推荐开瓶后分装保存以减少污染风险保证实验稳定性。
RNA 在 Buffer RT 中时不会被 RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase 的离心管或玻
璃器皿。
RNA 提取操作及离心过程常温进行即可。
操作步骤：
1.请根据样品种类进行以下步骤（1a 为动物细胞，1b 为动物组织）
1a. 收集动物细胞： 悬浮细胞可直接 300×g 离心 5min 并仔细吸除上清留沉淀待使用；
单层贴壁细胞可通过直接裂解法（吸尽培养基留下贴壁细胞，待步骤 2 用 Buffer RT
裂解）或胰酶处理法（吸尽培养基留下贴壁细胞，用 PBS 清洗细胞，吸除 PBS 后
使用含 0.10%-0.25%胰酶的 PBS 使细胞脱落，加入含有血清的培养基使胰酶失活后
转入无酶 1.5ml 离心管中 300×g 离心 5min，吸除上清留沉淀待使用）
注意：收集细胞数量不要超过 1×107，收集细胞时一定要将细胞培养基去除干净，否则会导致步骤 2 时细胞裂解
不完全，影响 RNA 与吸附柱的结合，RNA 的产量降低。
1b. 动物组织匀浆处理： 将 10mg-30mg 动物组织转移入无酶 1.5ml 离心管中并加入
600μl Buffer RT（动物组织量不要超过 30mg）使用前请检查 Buffer RT 是否加入 β-
巯基乙醇，使用研磨杵或电动研磨机将动物组织彻底研磨匀浆。直接进行步骤 3.
2.加入 4℃预冷的 180μl Buffer RN 至细胞沉淀中，并于冰上孵育 5min。对于未消
化收集的培养在 3.5cm 培养皿中的细胞，可吸净培养基用 PBS 清洗一次后，直接
加入 4℃预冷的 180μl Buffer RN 至细胞培养皿中，然后用细胞刮刀轻轻刮动并转
移至无酶 1.5ml 离心管中，并于冰上孵育 5min。
对于提前离心沉淀在离心管中的细胞，通过轻弹离心管以使细胞沉淀彻底分散开。悬浮液应迅速澄清，表明质膜
立即溶解。注意：细胞沉淀的不完全分散可能导致裂解效率低下和 RNA 产量降低。
3.将上述裂解物在 4ºC 下以 300×g 离心 2min。将上清液转移到新的无酶 1.5ml 离心
管中用于细胞质 RNA 提取，沉淀用于细胞核 RNA 提取。如果在此过程的后续步
骤中使用相同的离心机，则保持离心室温状态。
上清液含有细胞质提取物。根据细胞类型的不同，它通常略带混浊和黄白色。沉淀含有细胞核，上清中为细胞质裂解物。
4.于步骤 3 种所得细胞质裂解物及细胞沉淀管中分别加入 600 µl Buffer RT（使用前
请检查 Buffer RT 是否加入 β-巯基乙醇或 DTT），充分涡旋混匀。
若沉淀物较多，可室温裂解 3-5min，期间摇匀 2-3 次
5.将 430μl 无水乙醇（96–100％）分别加入两管裂解物中，并用移液器将其充分混
合。 不要离心。
注意：从某些细胞系纯化 RNA 时，加入乙醇后可能会出现沉淀。 这不会影响后续提取过程。
6.将步骤 5 混匀后的两管溶液转移入无酶吸附柱中并套上 2ml 收集管，≥8000×g
（≥10,000rpm）离心 1min，弃废液，直至将溶液全部转移完成吸附。
吸附柱最大上柱量为 700μl，若溶液过多可分多次上柱。后续操作若无特殊说明吸附柱均置于 2ml 收集管中。
7.（可选步骤） 向吸附柱中央加入 80μl DNase Ⅰ 工作液，室温（15℃-25℃）静置
15min。配制 DNase Ⅰ 工作液： 取 10μl DNase Ⅰ储备液入新的 RNase-Free 离心
管中，并加入 70μl Buffer RDD，轻柔混匀。
注意：DNase Ⅰ 对物理变性特别敏感，所以混匀时请上下倒置轻柔混匀，切勿涡旋。请确认 DNase Ⅰ 工作液加入
到正中央的柱膜上，否则 DNase 消化效果会不理想。
8.向两个吸附柱中分别加入 700μl Buffer RW1，≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心 30s，
弃废液。
9.将两个吸附柱重收套回收集管中，向吸附柱中加入 500μl Buffer RPE（使用前请
确认 Buffer RPE 按要求加入 4 倍体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心
30s，弃废液。
注意区分细胞质与细胞核 RNA 的吸附柱
10. 重复步骤 9 一次。
11. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 以最大转速(~13,400×g)离心 3min 干燥柱子。
12. 将两个吸附柱分别套入新的 RNase-Free 的 1.5ml 离心管中，并置于无 RNA 酶的
环境中开盖静置 5-10min 至乙醇晾干。
若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的 RNA 的下游实验造成影响。
13. 向两个吸附柱膜正中央分别加入 30-50μl RNase-Free Water，盖上盖子室温静置
3-5 min。后置于离心机中 ≥12,000×g(≥13,000 rpm) 离心 3min 得到 RNA 溶液。
RNA 洗脱体积不应少于 30μl，否则影响洗脱效率。洗脱后的 RNA 溶液应置于-80℃储存。
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