Western Blot常见问题解析–技术篇
1.电泳中的问题
| 出现问题 | 原 因 |
| ︶条带呈笑脸状 | l凝胶不均匀冷却，中间冷却不好;电泳系统温度偏高 |
| ︵条带呈皱眉状 | l可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全 |
| 拖尾 | l样品溶解不好 |
| 纹理（纵向条纹） | l样品中含有不溶性颗粒 |
| 条带偏斜 | l电极不平衡或者加样位置偏斜 |
| 条带两边扩散 | l加样量过多 |
2. Western blot结果中背景高且不均匀
| 可能的原因 | 建 议 |
| 抗体浓度太高 | l一抗或二抗浓度太高会导致高背景，降低抗体浓度 |
| 使用的封闭液不兼容 | l对比不同的封闭缓冲液 |
| 非特异性位点封闭不足 | l优化封闭缓冲液，好的封闭缓冲液具有系统依赖性
l提高封闭液中蛋白的浓度 l优化封闭时间和/或温度。室温封闭至少1 h或者4°C封闭过夜 l在封闭液中加入Tween-20，Tween-20的终浓度为0.05% |
| 封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应 | l换一种不同的封闭液
l不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭，牛奶含生物素 l交叉反应的检测。封闭一张干净的膜，与抗体一起孵育，然后用超感应化学发光底物检测 |
| 洗涤不充分，增加洗涤次数和使用缓冲液的体积 | l降低HRP结合物的浓度
l如果洗涤液中无Tween-20，添加Tween-20使其终浓度为0.05% |
| 膜的曝光时间过久 | l缩短印迹膜曝光到胶片的时间
l按照说明书的指示，保证膜始终是湿润的 l用一张新膜 l保证膜完全被液体覆盖，避免其干燥 l在孵育过程中始终进行震荡 l小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合 l不能空手持膜，始终带干净手套或用镊子 |
| 缓冲液污染或结块沉淀 | l制备新的缓冲液 |
| 抗体浓度太高 | l若一抗和/或二抗浓度过高会产生高背景，降低抗体浓度 |
| HRP处产生聚集体 | l用0.2 μm过滤器过滤结合物 |
| 结合可产生斑点 | l用一种新的高质量的结合物 |
| 缓冲液中有污染 | l使用新的缓冲液
l缓冲液使用前过滤 |
| 操作设备被污染 | l保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁，无外缘污染物
l保证在转膜后没有凝胶留在膜上，蛋白可能黏在胶上导致背景 |
3. Western blot结果中信号弱或无信号
| 可能的原因 | 建 议 |
| 蛋白未转到膜上 | l转膜结束后，用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率。（注：总蛋白染色剂可能检测不到低量的抗原。）
l确保转膜过程中胶与膜完全接触。 l确保转印夹层排布正确 l确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜 l确保转印部件在电印迹过程中未过热 l使用正对照和/或分子量Marker l优化转印时间和电流 l确保样品制备条件优于蛋白印迹，为破坏样品的抗原性。（注意：许多蛋白不能在还原状态下进行） |
| 蛋白未完全结合到膜上 | l在转膜缓冲液中加入20%的甲醇促进结合。低分子量的抗原可能会穿过转印膜，需使用小孔径的膜进行。 |
| 抗体不足 | l增加抗体浓度。抗体与目标蛋白的亲和力可能很小
l抗体可能失活，可用斑点印迹检测其活性。 |
| 抗体浓度太高 | l使用太多一抗或二抗可能导致信号迅速消失，呈现出很弱的信号。 |
| 抗原不足 | l加入更多的蛋白进行跑胶
l抗原被封闭液掩蔽 l试用不同的封闭液 l优化封闭液中蛋白浓度 |
| 缓冲液中含有叠氮钠 | l叠氮钠是一种HRP的抑制剂，缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂 |
| 曝光时间太短 | l延长胶片的曝光时间（注意：超感应化学发光底物会持续发光至少6个小时） |
| 底物孵育时间太短 | l在使用超感应底物时需进行5分钟的底物孵育。 |
| 底物失活 | l超感应化学发光底物和超感应west膜室温状态下化学底物可保存至少12个月，超感应免疫膜化学发光底物可保存至少6个月
l为衡量底物的活性，准备一个小量的工作液在一个暗室内，加入少量的HRP结合物，会观察到绿光。如果未检测到光，底物或HRP结合物均有可能失活 l确保两底物无交叉污染两种底物试剂的污染可能导致活性下降 |
| 膜可以修复剥离重新用探针检测 | l在膜剥离过程中可能会有抗原损失或变性
l优化剥离程序 l如有必要可重新用探针检测 l避免在同一张膜上重复进行探针检测 |
| 在膜上消解抗原 | l封闭底物可能含有蛋白水解酶活性（如明胶） |
| 印迹膜保存时蛋白降解 | l准备一张新的印迹膜 |
4. Western blot结果中背景较高
| 可能的原因 | 建 议 |
| 膜封闭不够 | l延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液 |
| 一抗稀释度不适宜 | l对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度 |
| 一抗孵育的温度偏高 | l建议4℃结合过夜 |
| 选择的膜容易产生高背景 | l一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低 |
| 膜在实验过程中干过 | l实验过程中要注意保持膜的湿润 |
| 检测时曝光时间过长 | l减少曝光时间 |
5. Western blot结果中杂带较多
| 可能的原因 | 建 议 |
| 目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带 | l查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小 |
| 目的蛋白有其它剪切本 | l查阅文献或生物信息学分析可能性 |
| 样本处理过程中目的蛋白发生降解 | l加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作 |
| 上样量过高，太敏感 | l适当减少上样量 |
| 一抗不纯 | l纯化抗体 |
| 一抗或者二抗浓度偏高 | l降低抗体浓度 |
| 一抗特异性不高 | l重新选择或制备高特异性的抗体 |
6. Western Blot结果中无信号或显示信号弱
| 可能的原因 | 建 议 |
| 检测样本不表达目的蛋白 | l选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性 |
| 检测样本低表达目的蛋白 | l提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂 |
| 转移不完全或过转移 | l可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流 |
| 抗体不能识别测试种属的相关蛋白 | l购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白 |
| 一抗孵育时间不足 | l建议4℃结合过夜 |
| 二抗与一抗不匹配 | l选择针对一抗来源的种属的抗体 |
| 洗膜过度 | l洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20 |
7. 其它现象
| 出现现象 | 产生原因 |
| 膜上多处出现黑点或黑斑 | l抗体与封闭试剂发生非特异性的结合 |
| 反白（条带显白色） | l目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高 |
| 蛋白分子量偏低或偏高 | l胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶 |
8. 安全问题
| 操作有毒试剂时，带手套和口罩，且操作挥发性试剂应在通风橱中进行。 |