6.2.1实验目的

在大麦、麦芽、麦芽汁和啤酒产品质量控制中经常需要测定其中的β-葡聚糖含量，Megazyme方法很好的解决了测定中的系列问题，本方法能够在一天内测定50-100个样品。本方法现在也适用于燕麦产品及燕麦纤维产品β-葡聚糖含量测定。

6.2.2实验原理

样品水化后加入真菌多糖酶在pH6.5缓冲液中培养，提取液离心（或过滤）后加入β-葡萄糖苷酶，在葡糖糖氧化－过氧化酶缓冲液保护下产生葡萄糖。

Megazyme测试包：（可以测定100个样品）

⑴全套测定方法；⑵真菌多糖酶；⑶β-葡萄糖苷酶；⑷葡糖糖标准液；⑸大麦和燕麦纤维标准样品。

6.2.3实验试剂：

⑴真菌淀粉酶（bottle 1）〔（1-3）（1-4）β-D-葡萄糖4-葡聚糖水解酶〕：（活力>1000U/mL）

制备：1.0mL真菌淀粉酶用20mM NaH₂PO₄缓冲液（pH6.5）稀释至20.0mL。将溶液分装成5.0mL在冰箱中冷冻保存。最终真菌淀粉酶浓度50U/mL。

⑵β-葡萄糖苷酶（bottle 2）：（活力>40U/mL）

制备：将1.0mLβ-葡萄糖苷酶用50.0mM醋酸钠缓冲液（pH4.0）稀释至20.0mL。将溶液分装成5.0mL在冰箱中冷冻保存。最终β-葡萄糖苷酶浓度2U/mL。

⑶葡糖糖标准液：100μg⁄0.1mL，用0.2%叠氮化钠溶液溶解。

⑷大麦标准样品：含量见标签。

⑸燕麦纤维标准样品：含量见标签。

⑹NaH₂PO₄缓冲液制备（20mM，pH6.5）：3.12g NaH₂PO₄－2H₂O溶解于900ml蒸馏水中，用100mM氢氧化钠溶液（4g/L）将pH值调至6.5（大约需50mL），加0.2g叠氮化钠，将溶液定容至1L。4℃保存。

⑺醋酸钠缓冲液（50mM，pH4.0）：饱和醋酸（2.9mL）加入900mL蒸馏水，用1M氢氧化钠调节pH值至4.0，加0.2g叠氮化钠，将溶液定容至1L，4℃保存。

⑻葡萄糖氧化－过氧化酶缓冲液：建议使用Megazyme测试包里的高纯度葡萄糖氧化溶液和葡糖糖过氧化酶。将测试包的葡萄糖工作液（bottle 3）（50mL）稀释至1L。把测试包中的葡萄糖测定液（bottle 4）用1L葡萄糖工作液溶解（简称GOPOD）。为了保证GOPOD溶液的稳定性，应该在低温条件下在棕色瓶中避光保持。测定过程中从冰箱中取出的凉的GOPOD溶液可以直接加入测定管。

葡萄糖工作液包括：CaHPO₄－2H₂O（136.0g），NaOH （42.0g），酸（30.0g），叠氮化钠（4.0g）。

6.2.4仪器需求：

⑴聚丙烯具塞试管（35mL）；

⑵移液器：量程分别为100μL，200μL，5.0mL（用于Na₂HPO₄缓冲液和葡萄糖氧化－过氧化酶缓冲液），25mL（用蒸馏水）。

⑶顶载天平：1/1000g。

⑷漩涡混合器；

⑸分光光度计：510nm。

⑹水浴锅：40℃和100℃水浴锅各一个。

⑺秒表：一只。

⑻离心机：离心力100g。

⑼试验粉碎机：细度0.5mm。

6.2.5测定步骤：

⑴将燕麦用试验粉碎机粉碎成细度0.5mm的颗粒。

⑵仔细称量燕麦粉样品（0.5g左右），放入35mL聚丙烯具塞试管。样品需要已知水分含量，以便最后转为干基。

⑶向试管中加入1.0mL 50%（v/v）的乙醇溶液，使样品充分润湿。

⑷加入5.0mL NaH₂PO4缓冲液（20mM，pH6.5），在漩涡混合器上充分混合。

⑸将试管放入100℃水浴锅中保温5min。每隔0.5min取出快速在漩涡混合器上混合。前2.0min加热及混合效果对于结果影响较大。

⑹将试管在室温下降至40℃，向每个试管加入0.2mL真菌淀粉酶（10U）。试管加盖，震荡混匀，放入40℃水浴锅中保温1h。每隔10min将样品在漩涡混合器上混合。

⑺向每个试管加入24mL蒸馏水，将溶液体积调整为30mL。

⑻将试管放入离心机中，在1000g离心力下离心10min。

⑼用移液枪移取0.1mL样品液，分别放入3个玻璃试管。一个玻璃试管作对照，另外两个为代测样品。

⑽按如图6.1所示加入试剂。黑色方框为比色杯。一次可以同时完成11个样品的测试。

⑾将玻璃试管放入40℃水浴锅中保温15min。

⑿向每支试管加入3.0mL GOPOD溶液，在40℃水浴锅中保温20min。

 

⒀将试管中液体转入1.0cm比色杯，在510nm测定吸光度。1h内完成测定。

⒁计算β-葡聚糖含量：

样品干重＝样品重量×（100-水分含量）/100

β-葡聚糖含量（％ w/w）＝吸光度×F×300×（1/1000）×（100/W）×（162/180）

＝吸光度×（F/W）×27

F＝100/葡糖糖标准溶液吸光度；

300为体积校正系数；

162/180为将游离葡萄糖转化为脱水葡萄糖；

W＝样品干重；