修饰性PEG常规基团的作用及分子量确定

PEG修饰是一个使多肽或蛋白质在治疗或生物技术方面的效力得以提高的重要过程。当PEG以适当的方式连接在蛋白质或多肽上时，它能改变许多的特征，而主要的生物活性功能，如酶活性或特异结合位点，可以保留下来。

PEG修饰通过如下几种途径改善药物的性能。首先，PEG连接在蛋白质或多肽的表面上，提高了它的分子大小，并且它还能携带大量的水分子，一种PEG-蛋白质因而增大了5～10倍。其次，PEG修饰使得以前不溶的蛋白质不仅容易溶解，而且具有高度移动性。此外，PEG修饰可以减少肾脏对药物的滤过作用，降低它的致热原性，还可以减少蛋白酶对其的消解，通过保护分子免受人体免疫系统的攻击来改善了它的输送。同时，因为它逃避了人体防御机构，因而在作用部位停留的时间就长得多，并使局部药物浓度增高。

目前在国外上市的PEG-多肽(或PEG-蛋白质)产品有：Schering-Plough公司的PEG-Intron，于2001年1月22日由FDA批准上市。它采用了Enzon公司开发的专利PEG技术。这种重组干扰素α-2b与一个12,000 dalton PEG分子连接，使其抗病毒活性和消除半衰期之间达到佳平衡。Enzon还有两种已经被FDA通过的PEG修饰蛋白商品：ADAGEN和ONCASPAR。ADAGEN用于缺失ADA而引起的严重联合免疫缺陷病（SCID）；ONCASPAR即PEG修饰的天冬酰胺酶（L-asparaginase），用于治疗急性淋巴细胞白血病（ALL），天冬酰胺酶需要隔天注射，而PEG修饰后可以一周注射一次，还可以减少过敏。

另外，罗氏公司生产的抗病毒性肝炎特效药派罗欣，日前获得了瑞士国际药品管理署的销售许可。瑞士权威机构的认证是基于两个国际多中心三期临床试验的结果，该试验表明，每周注射一次派罗欣可以获得长久的持续病毒学反应，疗效比标准干扰素高出许多。特别是对伴有肝硬化的难治性患者也有显著的效果。它采用了Shearwater的PEG修饰技术，即运用mPEG2-NHS作为活化PEG，分子量40,000 Dalton，而干扰素为19,000。另外，世界头号生物技术公司Amgen公司开发的新药SD/01已于去年年底上市。SD/01就是用PEG修饰的粒细胞集落刺激因子G-CSF，是Amgen公司的早期产品G-CSF的长效型。而G-CSF的99年销售额是12.2亿美元，2000年是12.6亿美元，这就可以看出PEG产品的市场十分巨大。

PEG修饰GLP-1的意义

GLP-1是一种30个氨基酸长度的肽类激素。通常情况下，这种长度的肽类激素口服无效，需要注射或其他适合肽类药物的给药方式（如，肺部或颊内给药）与胰高血糖素相似，GLP-1易形成原纤维，因此十分难溶于水。最近有许多文献报道GLP-1难于形成混合物，难于形成药物。GLP-1的药动学性质更加大了这一难题。二肽酶IV迅速降解GLP-1，其产物不仅没有活性，还可以充当GLP-1受体的拮抗剂，产生相反的作用。同时，肾小球对GLP-1的滤过十分迅速。由于以上原因，GLP-1在人体中的半衰期十分短，静脉注射只有1.5分钟，皮下注射有1.5小时，都不适合用作药物。针对以上不足，对GLP-1的修饰成为了研究的热点。现在正处于临床中的Novo Nordisk A/S公司开发的GLP-1都经过了脂肪酸修饰，活力保持良好，半衰期可达12小时以上，完全可以做到每日给药一到两次。采用PEG修饰，不仅可达到同样的效果，而且可以避免专利纠纷，且PEG修饰的技术更为成熟，修饰物的原料更易获得。

另外，从技术上讲，Lys是大多数PEG修饰选择的位点，有许多类型的PEG可选择。GLP-1具有两个Lys，且均处于非活力部位，因此为修饰提供了很大的灵活性。

PEG化学

多肽的修饰项目包括PEG大小的确定，活化类型的确定，以及活化PEG的获取；多肽的获取；多肽修饰位点的确定，活性基团的保护，连接反应条件的控制，以及产品的表征。还包括多肽修饰物的活性测定和半衰期测定。

反应位点的初步确定

对于多肽，依反应类型分为对巯基、氨基等基团的反应，和对羧基的反应。反应中作为亲核试剂的活性基团有（依活性大小）：巯基、alpha-氨基、epsilon-氨基、羧酸酯和羟基。这个顺序不是绝对的，还和pH等其他因素有关。巯基在蛋白质中含量很少，而且经常和活性中心有关，不适合作为PEG结合的位点。而羧酸酯活性不高，故氨基是PEG修饰的常用基团。但是也有例外的情况，如氨基对多肽的活性有很大的影响时，那就要选择羧基作为结合位点。所以究竟选择何种基团作为结合位点，要根据多肽的具体情况综合考虑。

PEG活化类型的确定

PEG活化，即将末端的羟基转化为活性基团。根据修饰位点的不同一般分为两类：针对氨基巯基等基团的活化，和对羧基的活化。前者又分为烷基化活化和酰胺化活化，烷基化修饰产物不会改变氨基酸残基的电荷。如果氨基的正电性对生物活性很重要的话，烷基化修饰将是一个好方法，但是反应不是专一性不强。如环氧烷基PEG，反应性差，专一性不强，多肽的羟基也可能与之反应。另外就是酰胺化活化，重要的有hydroxysuccinimidyl esters(–OSu)和chloroformates or carbonylimidazole活化。–OSu对氨基有很高的反应活性，后者由于活性不太高，但选择性较好。–OSu是使用较早、也比较广泛的活化方法，如SS-PEG和SC-PEG，以及它们的替代物SPA-PEG、SBA-PEG和BTC-PEG。

PEG分子量大小的确定

一般来说，分子量为5，000和12，000Dalton的PEG是比较常用的，具体的大小要根据蛋白质或多肽的大小及修饰的目的来确定。Schering-Plough公司的PEG-Intron，PEG是12KD，intron是19KD，而Roche则采用了40KD的分枝式PEG来修饰intron。对于3 KD的小肽，5 KD的PEG可能比较合适。

另外，当氨基酸或是多肽出现在PEG和蛋白质或多肽之间时，将会改变它们的某些特征，并且这种改变可能会有利于蛋白质。一种情况是氨基酸通过氨基与PEG结合，使得羧基得到活化，易于和蛋白质结合。这一类修饰中正亮氨酸是很有价值的。另一种情况是具有三功能基团的氨基酸，它通过两个功能基团（通常为氨基）与PEG结合，剩下一个功能基团与蛋白质结合。这样将形成一个伞状结构，它抵抗蛋白质的消化，阻止抗体的结合，降低免疫原性。这种修饰方法还可以避免对活性位点的结合。

在PEG修饰过程中存在如下值得关注的问题：

一是在PEG方面。PEG作为一种人工合成的多聚物，具有多分散性，其分散值（Mw/Mn）可从小分子多聚物（3-5Kd）的1.01，到大分子的1.20（20Kd）。这对修饰工作是不利的。目前可用MALDI质谱仪测量这个值。在修饰工作中，PEG一端一般被甲氧基化。但是，仍有1-10%的PEG二醇存在。我们在使用处理过的单甲氧基PEG之前，最好要检验它的纯度。PEG二醇将会引起不期望的交叉连接。另外，PEG的分子量也会对修饰的多肽或蛋白质的性质有重要影响。多种例子证明，PEG分子量越大，多肽或蛋白质的半衰期就越长，活性越低。

二是在修饰过程中，考虑到多肽及PEG的不稳定性，反应必须在温和的条件下进行。

三是对PEG连接反应的表征。我们要确定PEG是否连接上和连接的数目，以及连在哪个氨基酸残基上。前者可通过MALDI-TOF质谱仪或凝胶层析（GPC）分析，后者可以通过对多肽的逐步水解来确定结合位点。PEG的数目以及修饰的位点对于多肽类药物是很重要的，因此表征工作不可忽视。

四是副反应问题，PEG在连接反应中也有可能和酪氨酸、组氨酸残基等不期望的氨基酸结合，如在EGF（表皮生长因子）的PEG修饰中，通过MALDI质谱发现多了一条PEG链，它就接在了酪氨酸残基上。这也体现了表征工作的重要性。

修饰性PEG常规基团

上海金畔生物科技有限公司提供以下系列产品生产技术转让或技术合作，提供定制合成系列功能团修饰性PEG衍生物或各种功能聚合物系列：

1.mPEG (单甲氧基醚PEG)(monomethoxypoly(ethylene glycol)) 或者mPEO (monomethoxypoly (ethylene oxide))
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2OH
能够合成二醇含量很低的mPEG

2.mPEG-NH2(mPEG-胺基) mPEG-amide
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH2
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2CH2-NH2
带有伯胺端基的mPEG是一种非常有用的功能化高分子。在mPEG上的胺端基，对于酰化试剂的活性比羟基高，因此，它们很容易进行还原氨基化反应。应用胺基的反应活性，我们可以很方便的通过生成稳定的化学键(如酰胺键，氨基甲酸酯键，脲键和仲胺键), 把另一些分子和其连接。它们可用于：
制备带有生物活性化合物的配体；
多肽合成时的载体；
制备高分子接枝物和PEG涂层；
制备PEG糖蛋白配体；
3. mPEG-SS (mPEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯)( mPEG-succinimidyl succinate)
mPEG-SS是较早使用带活性基团的PEG，它的反应活性较高，但是由于和PEG主链连接的是酯键，因此，在强碱或强酸条件下，酯键易断裂水解，使活性基团的含量下降。

4. mPEG-SC(mPEG-琥珀酰亚胺碳酸酯)( mPEG-succinimidyl carbonate)
mPEG-SC是目前最常用的带活性基团的PEG衍生物，它和蛋白偶合生成的氨基甲酸酯键比酯键要稳定，现广泛用于与药物的偶联反应中。

5. mPEG2-NHS(mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺酯) (mPEG2- N-hydroxysuccinimde)
通过把mPEG偶联到赖氨酸上得到含有羧基的双臂mPEG2-COOH, 然后再与NHS活化后得到双臂mPEG琥珀酰亚胺酯（mPEG2-NHS）。mPEG2-NHS具有许多优点，其产物的支化结构会产生较大的分子体积，这样它们就不大可能渗透到蛋白质空间位阻大的区域。在和蛋白偶联后，不需要太多的偶联点便可使偶联产物保留PEG所具有的特点。mPEG2试剂尽管其水解速率及与小分子的反应速率比大多数NHS活性酯快，但与蛋白质的反应速率却要慢一些。这是由于其较大的空间位阻的缘故，因此适当延长和蛋白质的反应时间是必要的。

6. mPEG-SPA(mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酸酯) ( mPEG-succinimidyl propionate)
PEG羧酸的NHS活性酯是最常用来与蛋白质偶合的PEG衍生物。它能与蛋白质上的赖氨酸的胺端基反应生成稳定的酰胺键。mPEG-SPA主链中不含有酯键，因此稳定性较高，其在PH等于8的水溶液中的半衰期为16.5分钟，大大高于mPEG-SS的9.6分钟。

7. mPEG-ALD (mPEG-丙醛) ( mPEG-aldehyde)
在硼氢化钠存在下，带醛基的PEG会和伯胺发生还原氨化反应。醛基和其它的亲电活性基团不同，它只和胺基反应。虽然醛基的反应活性比NHS活性酯低，但是它具有反应条件温和(pH 6-9.5，6~24小时)，易于使PEG和蛋白质或其它材料的表面连接。因此，在较低的pH下，mPEG-ALD会对蛋白质的N端进行选择性反应。其连接的稳定性（通过还原反应形成仲胺）对于制备固定化酶是极其重要的。用这种方式改性的蛋白质，可以保留氨基和蛋白在溶剂中的带电性，这对于保持蛋白质的构造和活性是非常重要的。通过氨基酸分析方法对蛋白质水解物中的赖氨酸进行定量分析，可以很方便地对这些偶合产物进行表征。mPEG-ALD是蛋白质N端PEG化的通用试剂。

8. mPEG-MAL(mPEG-马来酰亚胺) ( mPEG- maleimide)
马来酰亚胺和巯基的偶合是蛋白和多肽偶联中的一个非常有用的反应。这个反应很特别，即使在其它功能基存在下，它也可以在温和的条件下进行。作为有活性端基的聚合物，mPEG-MAL已被用来合成具有确定结构和生物活性的PEG-蛋白质偶合物。mPEG-MAL也常用作聚合物试剂来选择性诱捕含巯基的多肽。

9. HO-PEG-COOH(a-羟基-w-羧基聚乙二醇) (α-hydroxyl-PEG-ω- carboxyl)

10. mPEG-b-PS (聚乙二醇和聚苯乙烯的嵌段共聚物) (mPEG-block- polystyrene)；

11. mPEG-b-PI(聚乙二醇和聚异戊二烯的嵌段共聚物) (mPEG-block- polyisoprene)；

12. mPEG-b-PAN(聚乙二醇和聚丙烯腈的嵌段共聚物) (mPEG-block- polyacrylonitrile)；

13. mPEG-b-PCL(聚乙二醇和聚ε-己内酯的嵌段共聚物) (mPEG-block- poly(ε-caprolactone))；

14. mPEG-b-PMMA(聚乙二醇和聚甲基丙烯酸甲酯的嵌段共聚物) (mPEG-block- poly(methyl methacrylate))；

15. PEG (双羟基PEG)HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2OH (分子量分布<1.15)各种分子量均能提供；

16. HO-PEG-NH2(α-羟基-ω-氨基聚乙二醇) (α-hydroxyl-PEG-ω- amide)；

17.mPEG-羧基（mPEG-carboxyl），各种分子量的产品，其纯度>95%。

18.mPEG-腈基 (mPEG- cyan)各种分子量的产品，其纯度>95%。

19. mPEG3-COOH 和mPEG3-NHS；

20. 三臂PEG以及四臂PEG（端基均为羟基）各种分子量；

21.超支化的聚丙三醇hPG (hyperbranched poly(glycerol);

22.Y型结构；

23.枝状结构；

24.各种分子量的超支化PEG.