Porcine Intestinal Organoid Kit 猪小肠类器官培养试剂盒

货号：K2269-PI

规格：100ml

500ml

品牌：bioGenous

产品介绍

bioGenous^TMPorcine Intestinal Organoid Kit（猪小肠类器官培养试剂盒）是一款用于建立和维持猪小肠干细胞来源类器官的完全培养基。生长在该完全培养基中的猪小肠类器官主要由肠干细胞、肠祖细胞和肠绒毛细胞、潘氏细胞、杯状细胞和少量肠内分泌细胞组成，在自我更新能力、组织结构、细胞类型和功能方面，猪小肠类器官重现了体内小肠上皮的特征，因此是肠道体外研究的理想体外模型。

技术参数

产品信息：

猪小肠类器官完全培养基的制备

使用无菌操作技术配制猪小肠类器官完全培养基，以配制10 mL为例，如所需量不同，可相应调整用量。

1.         冰上解冻Porcine Intestinal Organoid Supplement B (50x)和Porcine Intestinal Organoid Supplement C (250x)。

注意：解冻后，建议将Porcine Intestinal Organoid Supplement B (50x)和Porcine Intestinal Organoid Supplement C (250x) 分别分装后保存取用，避免反复冻融。

2.         将200 μL Porcine Intestinal Organoid Supplement B (50x)，40 μL Porcine Intestinal Organoid Supplement C (250x) 加至9.76 mL Porcine Intestinal Organoid Basal Medium中，充分混合，配制成10 mL猪小肠类器官完全培养基。

注意：配制后的猪小肠类器官完全培养基可在2 – 8°C储存，建议在两周内使用。Porcine Intestinal Organoid Supplement B(50x)内含有细菌及真菌抗生素(50x)。

猪小肠类器官原代培养

1.         依据所在单位批准的实验动物伦理及操作规范进行动物组织取材，取材后的组织须在2 – 8℃组织保存液或DPBS中迅速转运至洁净实验室进行组织处理和干细胞分离。

2.         准备若干培养皿，加入4℃预冷的DPBS备用。

3.         标准手术操作分离猪肠组织，根据实验需求取总长度1 – 10 cm的小肠段，置于含DPBS的培养皿中。

4.         于生物安全柜中使用移液管将小肠一端注入DPBS以冲洗肠内容物，冲洗后置于新的含DPBS的培养皿中，反复冲洗数次至内容物完全被冲洗干净，置于新的含DPBS的培养皿中。

5.         使用手术剪将肠管剪开，肠腔面朝上，一只手持手术镊夹住肠组织一端，另一只手持手术刀片轻轻刮去肠腔表面肠绒毛，待肠绒毛被刮净后，将肠组织置于新的含DPBS的培养皿中清洗，重复清洗一次。

6.         将清洗后的小肠组织剪碎至约2 mm长宽，并转移至5–10 mL含有2 mM EDTA的预冷DPBS中消化，4℃孵育30min。

7.         消化完成后，将组织碎片转移到新的含DPBS的培养皿中清洗，重复一次以去除EDTA。

8.         用5 mL移液管在含冷的DPBS的培养皿或50 mL离心管中吹打、重悬组织碎片，使组织反复穿过移液管尖以产生机械剪切力从而使隐窝与基底层分离，取一部分悬液镜检，当可以看到大量的隐窝样结构后，停止吹打并将吹打后的组织悬液通过70μm滤器过滤。

9.         收集滤液，300×g，4℃离心3 min。

10.     弃上清，使用1 mLDPBS重悬组织沉淀，取20 μL悬液进行镜检和隐窝计数，计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液，300×g，4℃离心3 min，弃上清后置于冰上预冷。

11.     用适量的Matrigel重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每25 μL Matrigel悬液包含100 – 500个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过30 s以避免Matrigel过早凝固。

注意：Matrigel 稀释比例应在70%以上以保证培养过程中Matrigel的结构稳定性。

12.     将Matrigel和组织细胞小心均匀混合以防止气泡产生并将悬液加入24孔板，25μL每孔滴加在孔底中心，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：为防止Matrigel室温凝固，此步骤应尽快完成。

13.     将接种完成后的培养板置于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固后取出。

14.     提前配制猪小肠类器官完全培养基。

注意：原代或细胞分选后的类器官建立，需要在前2 d的培养体系中加入10 μM的Y27632。

15.     每孔沿孔壁加入500 μL提前预热的猪小肠类器官完全培养基，再向24孔板最外周孔中每孔加入500 μL无菌水，置于37℃温箱、5% CO₂条件下培养。

注意：请沿孔壁缓慢加入，避免破坏已凝固结构。

16.     每 3 d更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏Matrigel。

17.     密切监测类器官生长状态，理想情况下应在5 – 7 d内建成。

猪小肠类器官传代培养

1.         用经过Anti-Adherence Rinsing Kit (E238002)润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基的悬液转移至经过Anti-Adherence Rinsing Kit润洗的1.5mL EP管中。

2.         用经过Anti-Adherence Rinsing Kit润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液，多次吹打使得类器官与Matrigel分离。

3.         300×g，4℃离心3 min，弃上清，用经过Anti-Adherence Rinsing Kit润洗的枪头加入200 μLOrganoid Dissociation Solution（E238001）并充分混匀，37℃条件下消化1 – 3 min，消化结束后加入1 mL Epithelial Organoid Basal Medium 吹打混匀。

4.         300×g，4℃离心3 min，弃上清，再次加入1 mL Epithelial Organoid Basal Medium 并混匀。

5.         300×g，4℃再次离心3min，弃上清后置于冰上。

6.         用适量的Matrigel重悬类器官沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过30 s以避免Matrigel过早凝固。

注意：Matrigel 稀释比例应在70%以上以保证培养过程中Matrigel的结构稳定性。

7.         将Matrigel和类器官的混合悬液点入24孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔30μL左右。

注意：为防止Matrigel室温凝固，此步骤应尽快完成。

8.         将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固后取出。

9.         配制猪小肠类器官完全培养基。

10.     待Matrigel完全凝固后，沿孔壁加入提前预热的猪小肠类器官完全培养基，24孔板每孔500μL。

11.     将24孔板置于37℃二氧化碳培养箱中培养，待长出新的类器官之后可进行后续实验。