培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒品牌：genefist | 货号：GF430 
选配的试剂
溶菌酶（50mg/ml）目录号：GF0203-01，客户自备，提取细菌总 RNA 时需配备
储存条件
DNase I（为DNase I 冻干粉溶解于专用保存液），储存于-20℃；
其他试剂室温（15-25℃）保存。
产品简介
培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒，提供了快速简单且有效的方法，可从培养细胞和细菌中提取总RNA。本试剂盒采用离心管柱的方式，配合使用我司独特的硫氰酸胍裂解液，使细胞或细菌裂解及均质化，并加入乙醇使RNA选择性的与管柱膜结合，于操作过程中加入DNase Ⅰ以去除残留的基因组DNA，经过多次“洗涤及离心”的步骤去除污染杂质，再以无核酸酶水回收结合在管柱膜上的RNA。若RNA小于200nt,如5sRNA、tRNA和microRNA,无法在此系统中被有效地回收。提取的总RNA纯度高，基本没有DNA和蛋白质污染，可用于PCR、芯片分析、Blot、PolyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。
预防RNase污染，应注意以下几方面
1.经常更换新手套，因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
2.使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3.RNA在裂解液RL中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 h，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10 min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4.配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(V/V)，高压灭菌）。
使用前注意事项
1.裂解液 RL：使用前请添加 300ul 巯基乙醇，添加过巯基乙醇的裂解液 4℃保存。
2.漂洗液 PW：使用前请添加 64ml 无水乙醇。
3.为确保 RNA 的品质及产量，应尽量收取新鲜的动物组织进行 RNA 提取，或将组织立即以液氮冷冻，储存于-70℃，组织亦可保存在 RANstore 样本保存液（目录号：TR38）中。样本保存在 RNAstore 试剂中，可于37℃存放 1 天、4℃存放 1 个月、-20℃永久保存，所提取的 RNA 品质与储存在液氮中相同。
操作步骤
一、从培养细胞中提取总 RNA
1.收集细胞
a.悬浮细胞的收集（收集细胞数量请不要超过 1×107）：估计细胞数量，300×g 离心 5 min，将细胞收集到离心管中，仔细吸除所有培养基上清。
b.单层贴壁细胞的收集（收集细胞数量请不要超过 1×107）：可直接在培养容器中裂解（容器直径不超过10 cm），或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。（在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法。）
直接裂解法：确定细胞数量，彻底吸除细胞培养基上清，立即进行第 2 步裂解步骤。
胰蛋白酶处理法：确定细胞数量，吸除培养基，用 PBS 洗涤细胞，吸除 PBS，向细胞中加入含有0.10-0.25%胰蛋白酶的 PBS 处理细胞，当细胞脱离容器壁时，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至 RNase-Free 的离心管中，300×g 离心 5 min，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清。
注意：收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不完全，影响 RNA 与吸附柱的结合，
造成 RNA 的产量降低;请勿使用过多的样本量，避免管柱杜塞而造成 RNA 的产量降低。
2.裂解处理
a.对于离心得到的细胞沉淀：轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加入适量裂解液 RL（详见下表，使用
3.将所有溶液转移至过滤柱 CS1 上(过滤柱 CS1 放在收集管中)，12,000 rpm(~13,400×g)离心 2min，收集滤液。
4.向滤液加入等体积 70%乙醇至裂解液中，混匀（此时可能会出现沉淀）。
5.将“裂解液/乙醇混合液”（含沉淀）移取至吸附柱 CR1 中（吸附柱 CR1 放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g )离心 30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CR1 放回收集管中。
注意：将溶液和沉淀转移至吸附柱 CR1 时，如果体积大于吸附柱容量，可以分次完成。
6.向吸附柱 CR1 加入 500ul 溶液 RW，12,000 rpm (~13,400×g )离心离心 1 min，丢弃滤液。
7.DNase Ⅰ降解。
每一纯化反应，请将 80 ul DNase 消化液与 10ul DNaseⅠ预先混合在新的离心管(轻弹或翻转离心管以混合均匀，请勿震荡)，将 90 ul “DNaseⅠ工作液”加入至吸附柱的膜中心，于室温（25~28℃）孵育15 分钟。
注意：如同时操作多组样本，请使用前现配新鲜的 DNaseⅠ工作液,请勿预先配制保存 DNaseⅠ工作液。
8.向吸附柱 CR1 中加入 500μl 溶液 RW，12,000 rpm(~13,400×g)离心 1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CR1 放回收集管中。
9.向吸附柱 CR1 中加入 600μl 漂洗液 PW（使用前请先检查是否已加入乙醇），12,000 rpm(~13,400×g) 离心 1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CR1 放回收集管中。
10.重复操作步骤 9。
11.12,000 rpm(~13,400×g)离心 3 min，将吸附柱 CR1 置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。
注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱 CR1 在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的 RT 等实验。
12.将吸附柱 CR1 转入一个新的 RNase-Free 离心管中，加入 30-100 μl 无酶双蒸水至吸附柱的膜中心，室温静置 2 min，12,000 rpm(~13,400×g)离心 1 min，得到 RNA 溶液。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于 30 μl，体积过小影响回收效率；RNA 溶液请于-70℃保存。
二、从细菌中提取总 RNA
1.4℃12,000 rpm(~13,400×g)离心 2 min 收集菌体（收集菌体的最大量不超过 1×109），仔细去除所有培养基上清，以后的所有离心步骤均在室温（20-25℃）进行。
注意：如果培养基上清去除不完全，将对第二步中的细胞壁消化过程产生抑制。
2.用含有溶菌酶的 100μl TE 缓冲液（客户自己配制，配制方法见下表）彻底重悬菌体，孵育时间见下表。
3.加入 350μl 裂解液 RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），涡旋振荡混匀。
4.将裂解混合液转移至过滤柱 CS1 上(过滤柱 CS1 放入收集管)，12,000 rpm(~13,400×g)离心 2min，收集滤液。
5.向滤液中加入 250μl 无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀）。
6.将“裂解液/乙醇混合液”（含沉淀）移取至吸附柱 CR1 中（吸附柱 CR1 放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g )离心 30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CR1 放回收集管中。
注意：将溶液和沉淀转移至吸附柱 CR1 时，如果体积大于吸附柱容量，可以分次完成。
7.向吸附柱 CR1 中加入 500ul 溶液 RW，12,000 rpm (~13,400×g )离心离心 1 min，丢弃滤液，将吸附柱CR1 放回收集管中。
8.DNase Ⅰ降解。
每一纯化反应，请将 80 ul DNase 消化液与 10ul DNaseⅠ预先混合在新的离心管(轻弹或翻转离心管以混合均匀，请勿震荡)，将 90 ul “DNaseⅠ工作液”加入至吸附柱的膜中心，于室温（25~28℃）孵育15 分钟。
注意：如同时操作多组样本，请使用前现配新鲜的 DNaseⅠ工作液,请勿预先配制保存 DNaseⅠ工作液。
9.向吸附柱 CR1 中加入 500μl 溶液 RW，12,000 rpm(~13,400×g)离心 1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CR1 放回收集管中。
10.向吸附柱 CR1 中加入 600μl 漂洗液 PW（使用前请先检查是否已加入乙醇），12,000 rpm(~13,400×g)离心 1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CR1 放回收集管中。
11.重复操作步骤 10。
12.12,000 rpm(~13,400×g)离心 3 min，将吸附柱 CR1 置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。
注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱 CR1 在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的 RT 等实验。
13.将吸附柱 CR1 转入一个新的 RNase-Free 离心管中，加入 30-100 μl 无酶双蒸水至吸附柱的膜中心，室温静置 2 min，12,000 rpm(~13,400×g)离心 1 min，得到 RNA 溶液。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于 30 μl，体积过小影响回收效率；RNA 溶液请于-70℃保存。
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