M-MLV 逆转录酶
产品说明
M-MLV逆转录酶是由一个 71 kD的单亚基组成的重组型DNA逆转录聚合酶。可以催化以RNA或DNA：RNA杂交链为模板的互补DNA 的聚合反应。本酶经修饰RNase H活性比普通的逆转录酶要弱很多，因此在合成第一链cDNA的过程中，可保证RNA的降解程度较低，从而使得率提高。
产品组分
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组分 |
R1041 |
R1042 |
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M-MLV (200U/μl) |
5000U/25 μl |
10000U/50 μl |
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5× first-strand buffer |
100 μl |
200 μl |
R1041可进行25次逆转录反应，R1042可进行50次逆转录反应（20 μl 标准 PCR 反应体系，每次使用 M-MLV 1 μl）。
M-MLV 储存液成分
20 mM Tris-HCl (pH 7.5)，200 mM NaCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，0.01% NP-40，50% glycerol
5x first-strand buffer 成分
250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)，375 mM KCl，15 mM MgCl2，50 mM DTT
保存条件
-20℃保存，避免反复冻融。
质量检测
逆转录酶活性检测
使用[32P]dCTP作为标记，200 U的M-MLV以1μg、1.2 kb的RNA为模板进行逆转录反应，最低可得到120 ng的cDNA，所得cDNA长度 > 全长的90%。
核酸外切酶活性检测
混合50 ng的标记DNA或RNA与200 U M-MLV在1×反应缓冲液体系中，37℃温浴1 h，检测DNA和RNA降解都不到总量的1%。
核酸内切酶活性检测
混合1μgⅠ型超螺旋质粒DNA与500 U M-MLV在1×反应缓冲液体系中，37℃温浴1 h，琼脂糖电泳检测，无明显的剪切。
适用范围
第一链cDNA 合成；cDNA 文库构建；RT-PCR；引物延伸；3' 和 5' RACE。
注意事项
l 成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长的完整性并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或 SDS。用于cDNA合成反应的溶液试剂尽可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能用高压灭菌处理时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。
l 为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2 M同时加入4倍体积的乙醇，室温放置3-5 min，10,000 rpm离心5 min。
l 在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂（RNasin）以增加cDNA合成的长度和产量。在第一链合成反应中，RNase抑制剂在缓冲液和还原剂（如 DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放出RNase。但是RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C 对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了RNase抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。
l 较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加反应的产量。
l 使用简单的RNA纯化方法即可获得满足RT-PCR反应的RNA，但为了保证实验的成功率，建议使用GTC法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度RNA。
l 为防止RNA降解，应尽量避免反复冻融，最好保存于-70℃。
l 最佳的PCR反应条件，因PCR扩增仪的不同而不同，所以在使用您的样品之前最好先试做一下control反应，以确定最佳的PCR反应条件。
l cDNA产物应置于-20℃保存。
l 当以cDNA为模板进行PCR之前，使用RNase H处理cDNA，可以提高PCR反应的灵敏度。
操作步骤
1 在冰浴的无菌离心管中配制下列混合物
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RNA |
1-5 μg |
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Oligo (dT)15 或Random primer |
1 μl |
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RNase-free ddH2O |
To 13.4 μl |
2 进行变性退火反应
70℃温浴5 min，简短离心后冰浴5 min。
3 在上述离心管中配制反转录反应液
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上述反应液 |
13.4 μl |
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5× first-strand buffer |
4 μl |
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dNTPs（10 mM） |
1 μl |
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RNasin |
0.6 μl |
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M-MLV |
1 μl |
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Total |
20 μl |
4 按下列条件进行反转录反应
Oligo (dT)15 ：42℃温浴60 min；
Random primer： 37℃温浴60 min。
5 终止反应
70℃温浴5 min终止反应，置冰上进行后续实验或-20℃保存。
6 用RNase-free ddH2O将反应体系稀释到50μl，取2-5μl进行PCR扩增反应。