SYBR® Green qPCR Mix (with ROX)
Cat. #：P2091a，P2092a，P2093a
产品简介
SYBR® Green qPCR Mix是2X浓缩的实时定量PCR预混液，使用时只需加入模板和引物即可进行反应。采用创新的热启动机制可以减少引物二聚体和其他次级产物对反应的干扰，可以显著提高定量PCR的特异性、扩增效率，得到更广的可定量扩增区域。采用了新的增强剂，对各种目的片段 PCR 效率的波动可控制在最小范围内，反复冻融对扩增性能影响极小。本品配有进口参比染料ROX，适用于需要ROX校正的定量PCR机型，如ABI等。
产品组成
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Component
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P2091a
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P2092a
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P2093a
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2X SYBR® Green qPCR Mixa
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1 ml
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1 ml × 5
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1 ml × 10
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100X ROX Reference Dye*
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40 μl
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200 μl
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400 μl
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超纯水
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1 ml
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1 ml × 5
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–
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a 包含SYBR® Green I，Hotstart Taq DNA聚合酶，Aptamer，dNTP及反应缓冲液等。
* 所配ROX含量为最终反应体系的2%，请根据需要调整用量。
保存条件
SYBR® Green qPCR Mix -20℃避光保存2年，4℃避光可短期保存。ROX Reference Dye -20℃避光可长期保存。
质量控制
纯度检测：经质量检测，产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。
功能检测：经不同来源的模板和引物检测，产品具有优秀的特异性、灵敏性及可重复性等。
应用举例
1. 配制反应体系
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Component
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Volume
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Final concentration
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DNA template[1]
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0.5-2 μl
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1-4 μl
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Variable
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Forward primer (10 μM)[2]
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0.2 μl
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0.4 μl
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0.2 μM
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Reverse primer (10 μM)
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0.2 μl
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0.4 μl
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0.2 μM
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2X SYBR® Green qPCR Mix[3]
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5 μl
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10 μl
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1X
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100X ROX Reference Dye[4]
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Variable
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Variable
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Variable
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ddH2O
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Variable
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Variable
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–
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Total volume[5]
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10 μl
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20 μl
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–
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[1] DNA模板建议用量（10-20 μl体系）：1-10 ng cDNA，或10-100 ng gDNA。加样体积不宜过小，以免造成较大的误差，但是cDNA的量不宜超过总体积的1/10。因此模板建议浓度（加样前）：cDNA 1-10 ng/μl，gDNA 10-100 ng/μl。
[2] 引物终浓度建议范围：0.2-0.6 μM。特异性差时可降低浓度，效率低时可提高浓度。
[3] 如果熔解曲线出现杂峰，可以减少Mix用量至8 μl（20 μl体系）；如果对痕量模板的检出率较低，可以增加Mix用量至12 μl（20 μl体系）。
[4] 对于某些固定型号的仪器，需要添加ROX才能精确测定Ct值。ROX会给熔解曲线分析造成一定的背景干扰。因此，为了避免ROX的杂峰背景干扰，在应用软件的“Passive Reference Dye”中不要选择检测ROX荧光值选项，然后再进行数据的收集与分析。由于ROX的使用体积较小，建议将ROX提前与qPCR Mix混匀使用。ROX用量参照具体仪器说明，下表仅供参考。
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Instruments
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ROX (100X)
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ABI PRISM 7000/ PRISM 7700/ 7300/ 7900HT/ Step One/ Step One Plus/ GeneAmp 5700
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1-2% (High ROX)
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ABI 7500/ 7500 Fast/ ViiA 7/ QuantStudio 6/7/12K Flex; Agilent Stratagene Mx3000P/ Mx3005P/ Mx4000
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0.2% (Low ROX)
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Bio-Rad CFX96/ CFX384/ iQ/ iQ5; MJ Research Opticon 2/ Chromo 4; Roche LightCycler 480/ 96; Corbett Rotor Gene G/ Q/ 3000/ 6000; Thermo PikoReal 96; Eppendorf MasterCycler ep realplex; Cepheid Smart Cycler
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No ROX
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[5] 建议总体积不小于10 μl，以免造成较大的加样误差。具体体积范围参考仪器说明。
2. 设定反应程序进行qPCR反应
注：本品含有热启动酶，在60℃时会抑制酶活性，因此不建议使用两步法，推荐使用经典三步法或极速三步法。
经典三步法程序示例如下：
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Stage
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Temperature
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Time
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Cycle
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Initial denaturation
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94℃
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3 min
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1
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Denaturation
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94℃
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15 sec
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40
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Annealing
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55-65℃[1]
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15 sec
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Extension
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72℃
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20 sec
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Dissociation/Melting curve analysis（optional）[3]
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本品可用极速三步法快速完成反应，程序示例如下：
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Stage
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Temperature
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Time
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Cycle
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Initial denaturation
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94℃
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3 min
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1
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Denaturation
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94℃
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5 sec
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40
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Annealing
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55-65℃[1]
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5 sec
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Extension
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72℃
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5-10 sec[2]
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Dissociation/Melting curve analysis（optional）[3]
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[1] 最适退火温度需要摸索。退火温度一般设定为所用引物的Tm-5℃，若低于55℃，则以Tm值为退火温度，一般不低于55℃。
[2] 150 bp以内的扩增子可设置为5 sec；150-300 bp的扩增子可设置为10 sec；300 bp以上的扩增子可适当延长时间。
[3] 不同仪器熔解曲线采集程序不同，一般按仪器默认熔解曲线采集程序即可。可在延伸（三步法）或退火延伸（两步法）阶段采集信号，也可在反应结束后72 hrs之内采集（避光低温保存）。
3. 分析结果
观察扩增曲线；调整基线，计算Ct值；观察熔解曲线检测特异性；进行相对或绝对定量。
注意事项
使用前Mix需要完全解冻，充分混匀。尽量避免多次反复冻融。短期使用可避光保存于4℃。
将（n+x）份反应液混匀后再分注到n个单管中，可降低加样误差。（n为重复次数，x为损耗量，一般为n的1/10）
ABI的定量仪器大部分需要ROX校正管间差异，Bio-Rad的定量仪器不需要ROX校正。具体仪器请参照其使用说明。
轻轻混匀反应液，避免产生气泡，气泡会干扰荧光检测。可瞬时离心去除气泡。
引物的特异性、用量以及退火温度是影响实验结果的重要因素。务必设计特异性好的引物，随实验结果适当调整引物用量（0.05-0.9 μM）——特异性较差时减少引物用量，或以3℃为增量提高退火温度，扩增效率较低时增加引物用量。
DNA模板的量应小于500 ng/反应，过高的模板量会引起非特异性扩增。应根据模板类型与基因表达量适当调整用量。
熔解曲线的采集不是必须的，初次使用的引物建议进行熔解曲线采集。熔解曲线可以看出产物的特异性。产物特异性不好的原因有：引物特异性低；退火温度设置偏低；引物/模板浓度偏高；等。同时，建议通过琼脂糖凝胶电泳检测产物的特异性。
